基于Sanger和NGS测序的19例散发型梭形细胞血管瘤突变分析△▲
TenBroekRW,BekersEM，etal.
摘要
梭形细胞血管瘤(SCH)是一种发生于浅表软组织的血管肿瘤，由海绵状血管瘤样区域和实性梭形细胞区域组成，好发于年轻人，多见于肢体末端。大部分病例中伴有IDH1/2杂合子突变，偶见于Maffucci综合征。然而，由于嵌合现象及低比例的具有突变体等位基因的病变细胞，导致检测具有一定难度。本文应用Sanger测序、多重连接探针扩增技术(MLPA)、常规高通量测序(NGS)，以及基于单分子反转探针(smMIP)文库构等测序方法检测19例散发型梭形细胞血管瘤，并比较其诊断价值。10例应用Sanger测序，2例应用MLPA技术，其中Sanger测序检测到4例IDH1突变(p.RC)，MLPA技术检测到1例IDH1突变(p.RC)。应用smMIP/NGS进行检测剩余7例阴性病例和补充6例病例，显示IDH1(p.RC)热点突变8例，IDH2(两次p.RS和一次p.RG)热点突变3例。有1例是阴性的。由于DNA质量不佳及覆盖深度不足，去除2例。总共，17例中有16例成功检测到IDH1/2突变。考虑到应用smMIP/NGS检测在例其他血管病变中未检测到IDH1/2突变，该突变在梭形细胞血管瘤中具有高度特异性。
引言
梭形细胞血管瘤是一种罕见的血管性病变，主要由卡波西肉瘤样梭形细胞样和海绵状血管瘤样区域组成，Weiss和Enzinger首次描述，并命名为梭形细胞血管内皮瘤，基于其潜在的转移倾向，归类为低级别血管肉瘤[1,2]。此后，它在一组病例中考虑为良性病变，并伴有多灶性发生，而不是转移性疾病[3,5]，可能代表躯体障碍疾病[6,7]。
自年发现后，年首次报道Maffucci综合症具有特殊的血管病变。然而，梭形细胞血管瘤在Maffucci综合征中的发生率较低，高达9%的患者梭形细胞血管瘤旁边可见骨内软骨肿瘤；都是年轻患者[3]。
IDH1/2突变是Maffucci综合征中软骨和血管病变的遗传特征[6,7]，高度特异性的散发型梭形细胞血管瘤[8]、骨内散发型中央软骨肉瘤及内生软骨瘤中也有过报道[6]。相反，其他血管病变/异常中未见IDH1/2突变[8]。因此，IDH1/2突变可有助于鉴别诊断梭形细胞血管瘤与海绵状血管肿瘤[8]。
本文应用Sanger测序，多重连接探针扩增(MLPA)，常规下一代测序(NGS)和基于单分子反转探针(smMIP)构建文库法测序研究了19例梭形细胞血管瘤，并比较这些检测方法的诊断价值。此外，我们检测了例其他血管病变/异常来评估IDH1/2热点突变的特异性，并明确其在血管病变中鉴别诊断的价值。
材料与方法
??材料：
所有样本使用4%福尔马林缓冲液固定，常规处理后石蜡包埋，切片厚度4um。
??方法：
?NGS检测：
使用靶向肿瘤hotspotpanel(CancerHotspotPanelv2,ThermoFisher)和theIonTorrentPGM（ThermoFisher）进行测序[9]。
?smMIPs：
使用NextSeq(Illumina)构建文库进行检测。
?PCR和Sanger测序：
Chelex法(Sanger)、CobasDNAsampleprepkit(Roche，用于NGS分析)或直接裂解法(MLPA分析)从经福尔马林固定及石蜡包埋的组织(FFPE)中获取DNA，并使用Qubit法测定DNA浓度。获取的DNA用于PCR检测和Sanger测序。
?MLPA分析：使用P-C1kit(MRCHolland)分析。
?例血管病变分类基于年ISSVA分类[11]，见表1。
表1.IDH1/2野生型血管异常
结果
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临床资料
??19例患者的临床资料均基于病理报告和临床记录（见表2）。简而言之，10例女性患者，9例男性患者，年龄5-69岁（中位年龄36岁；平均年龄38岁）。14例患者肿瘤主要位于远端（5例位于足，2例位于脚趾，2例位于小腿，1例位于手指，3例位于前臂，1例位于前臂/手）。2例病变位于上臂，1例病变位于大腿，1例位于肩胛骨，1例位于腹壁。4例患者同一部位具有多灶性肿瘤（双脚和前臂可分别见两处病变）。
??根据组织学，病变位于真皮、皮下和骨骼肌，直径0.3~3.5cm(平均1.4cm)。所有肿瘤均完全切除。其中3例复发。根据临床资料，没有证据表明所有患者有Maffucci综合症或其他综合症的病史。
表02
临床资料
02
组织学特点
??大部分病灶为边界清楚的结节，海绵状血管瘤样区域内的血管多为扩张的薄壁血管，大小不一，充满血液（图1），部分梭形细胞成分较分散，疏密相间，细胞核大小一致（图2和图3）。部分区域内还含有数量不等的上皮样空泡状细胞，机化性的血栓有时伴有继发性钙化。此外，部分病变还伴有成片的嗜酸性粒细胞，平滑肌细胞。
??免疫组化显示，所有病例的内皮细胞均有CD31和CD34表达阳性，梭形细胞中CD34表达阴性。血管外周细胞，平滑肌细胞和梭形细胞中有SMA表达。3例病例HHV-8LANA染色阴性，排除卡波西肉瘤。
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