婴儿血管瘤（IH）是6-8月份婴幼儿快速生长的独特的生命周期常见的一种血管瘤，集中形成大量的血管，之后会变缓慢，3-7年之后自动退化。葡萄糖载体I（GLUT1）只有在血管瘤内皮细胞增殖期和退化期会表达。GLUT1免疫组化染色是用于区分IH和其他血管瘤和血管畸形。至今没有一个报道有关GLUT1在婴儿血管瘤开始和退化过程中的功能。
为鉴定血管瘤开始的细胞程序，本实验室从IH组织样本中分离血管瘤内皮细胞(HmEC)，血管瘤周皮细胞(HmPricyt)和血管瘤干细胞(HmSC)。HmSC以人干细胞标志物CD表达为基础进行纯化。HmSC的增殖迅速，显示间叶细胞表型，可以被诱导分化成内皮细胞，周皮细胞和脂肪细胞。
IH虽然是良性的，但还是会影响器官和组织，导致溃疡，给患者带来很大的美容影响。已发现皮质类固醇是一个历史悠久的IH治疗方法，抑制HmSC细胞VEGF-A的表达并在老鼠身上抑制HmSC形成血管样血管瘤。心得安，是一个无选择性β肾上腺素受体阻滞剂，是一个IH新的一线治疗药物。现在，有关IH生长的药物减缓或停止机制的信息很少，而且有时候心得安停止用药后会出现反弹情况。有研究报道，HmSC细胞用雷帕霉素和mTOR抑制剂预处理4天，在体内阻滞其形成血管能力，在体外降低其促克隆形成，增殖能力。此外，在严重IH，并其他治疗方法失效的患者中，雷帕霉素显示出一定的功效。尽管IH治疗方法进展了很多，但还是许多方面需要改进，假如药物结合治疗，防止IH大小太大危及生命，缩短IH持续时间等等。
本研究发现，在1岁大的婴儿IH样本中GLUT1+细胞的量显著地降低，肿瘤进入退化期，还证明了GLUT1+内皮细胞在跟肿瘤分离，并纯化以后，表现出干细胞样性能。
1.在增殖期与退化期IH中GLUT1+细胞含量的变化
用GLUT1和CD31双染色法染色增殖期和退化期的IH组织样本，观察GLUT1阳性细胞和CD31阳性细胞在IH组织中的含量，用流式细胞仪定量分析新分离的GLUT1+细胞和GLUT1ng细胞。结果发现，小于一岁的IH病人GLUT1阳性细胞比例明显比大于一岁的IH病人多很多，并且差异有统计学意义。
图1IH组织切片免疫荧光染色。箭头表示GLUT1阳性血管，*表示GLUT1阴性血管。细胞核用DAPI复染（蓝色）
图2流式细胞仪定量分析新分离的GLUT1+细胞和GLUT1ng细胞
2.在体外GLUT1sl细胞向间叶细胞表型的改变
GLUT1+EC和GLUT1ngEC用免疫磁珠法分离
图3GLUT1+EC和GLUT1ngEC分离示意图
立即通过QPCR检测，结果发现GLUT1+EC和GLUT1ngCD31+能表达内皮标记物CD31，VE-Cadhrin，VEGFR2和PlxinD1，但是不表达周皮细胞标记物PDGFRβ。结果见下图
图4QPCR结果
细胞继续培养10天后，GLUT1+EC细胞通过带CD31抗体的免疫磁珠分离，筛选出GLUT1+CD31+细胞。挑选出来的GLUT1+CD31+细胞命名为GLUT1sl细胞。通过QPCR再验证一次分离出来的细胞纯度（结果见下图）。
图5细胞培养10天后QPCR验证结果
细胞继续培养3周以后，GLUT1sl细胞表现出间叶细胞表型，跟GLUT1ngCD31+细胞有明显的差异，但是跟HmSC相似。
通过流式细胞仪检测以后发现，GLUT1sl细胞不会长期表达内皮细胞标记物CD31和VEGFR2，但是能表达间叶细胞标志物CD90,PDGFRβ和NG2。相比，GLUT1ngCD31+细胞表达内皮细胞标志物，但不表达CD90,PDGFRβ和NG2。两者也都不表达普通白血球标志物CD45。细胞进一步通过QPCR分析，发现GLUT1ngCD31+细胞细胞表达所有检测的内皮细胞标志物，包括：CD31,VECadhrin,JAGGED1,Angiopoitin-2,VEGFR2,PlxinD1，但是只有GLUT1和VEGF-A是低表达。相比，GLUT1sl细胞缺乏内皮细胞标志物，但是表达GLUT1和VEGF-A。注意的是，跟新分离的GLUT1+细胞比较，跟CD31表达水平一样GLUT1表达水平会降低。在培养的细胞中GLUT1表达下调是已知的。
图6B：细胞形态观察。C：流式细胞仪检测细胞表面抗原结果。D：QPCR检测基因表达结果。E表达量差异分析结果
再进一步通过肥皂精-细胞通透性流式细胞仪检测定位GLUT1蛋白细胞内的位置。
图7流式细胞仪细胞定位检测结果
总的来说，在体外培养表达3周以后，GLUT1sl细胞中内皮细胞标志物表达下调，并且转变成间叶细胞表型，GLUT1ngCD31+细胞保持内皮细胞表型。
3.GLUT1sl细胞在体外显示出血管祖细胞性能
GLUT1sl细胞的增值能力通过单细胞克隆形成方法进行评估，细胞培养14天以后检测结果。结果发现GLUT1sl细胞和GLUT1ngCD31+细胞的百分比分别是（71.6±1.3vs.51.5±5.8）。GLUT1sl细胞分离后，40.0±9.0%细胞能形成超过的边界清晰的克隆细胞群。这明显高于GLUT1ngCD31+细胞。因此，GLUT1sl细胞表现出了很强的克隆形成能力，这个性能跟许多干细胞和祖细胞的性能一样的，包括HmSC。
下一步观察GLUT1sl细胞是否能跟HmSC一样被诱导成内皮细胞，周皮细胞和脂肪细胞。将细胞培养在EC分化培养基5天，结果发现根对照培养基EGM-2比较，在GLUT1sl细胞中内皮细胞标志物VE-Cadhrin,PlxinD1和JAGGED1会增高。QPCR结果显示PlxinD1和JAGGED1mRNAs的表达都上调。CD31mRNA也表现出上调趋势。免疫荧光染色显示在EC分化GLUT1sl细胞明显表达重要的内皮转录因子ERG1。这表明在体外培养GLUT1sl细胞是内皮细胞标志物可以被重新诱导。
图8clonognicandcanbinducdtoundrgondothlialdiffrntiationinvitro
下一步观察GLUT1sl细胞是否能分化成周皮细胞/平滑肌细胞表型，重新培养正常内皮克隆形成细胞（ECFC）5天后，在GLUT1sl细胞中周皮细胞/平滑肌细胞标志物αSMA，calponin和sm22α会被诱导。这样的感应，GLUT1sl细胞从ECFC用CD31抗体免疫磁珠分离培养后被确证。蛋白表达水平确认了mRNA水平。因此，GLUT1sl细胞跟HmSC一样被诱导，表达αSMA,calponin,sm22α,PDGFRβ和NG2等pricyt/SMC标志物。另外GLUT1sl细胞用脂肪形成分化培养基培养以后，展现出成脂分化表型，形成脂滴和检测到Oil-Rd-O也表明这一点。
图9GLUT1sl细胞诱导表达pricyt/SMC表型和分化成脂肪细胞
以HmSC和人骨髓间叶干细胞作为阳性对照进行分析，GLUT1ngCD31+细胞和ECFC没有油滴迹象或者没有阳性Oil-Rd-O染色。总的来说，这实验表明在体外培养的GLUT1sl细胞具有高度克隆形成和内皮细胞，周皮细胞，和脂肪细胞分化的能力。性能跟HmSC是一样的。
下一步观察了GLUT1sl细胞在小鼠血管形成模型的分化能力。来自于3个不同IH病人GLUT1sl细胞皮下注射到裸鼠身上。14天以后，移植物收集，用HE染色显示出微血管和红细胞。量化结果显示来自于3个不同IH病人GLUT1sl细胞的血管形成量是类似的。
为观察形成的血管是否人的血管，用人CD31和老鼠CD31特殊型抗体染色。很多血管表示出人CD31抗体阴性，老鼠CD31抗体是阳性。人CD31阳性细胞群能检测到，但是没有观察到组织成血管。然而，这些紊乱的细胞类似于增殖期IH内皮细胞群。人calponin阳性细胞vimntin阳性细胞出现在来自管腔的老鼠CD31阳性血管，这表明在本动物模型上，人GLUT1sl细胞分化进入到血管周围组织。
脂肪细胞用anti-prilipinA染色，突出显示油滴。反核抗原抗体用于区别脂肪细胞来自于老鼠或者人GLUT1sl细胞的分化。结果显示，有些脂肪细胞来自于人GLUT1sl细胞的分化，有些脂肪细胞来自于老鼠。总的来说，免疫组化研究结果表明人GLUT1sl细胞能分化成内皮细胞，但是14天之内形成不了有功能的内皮细胞。在14天人GLUT1sl细胞能分化成围绕血管内皮细胞的血管周围细胞和脂肪细胞。
图10GLUT1slcllsformECs,pricyts/SMCsandadipocytsinimmunodficintmic
4.增殖期的GLUT1sl细胞雷帕霉素预处理
GLUT1sl细胞和GLUT1ngCD31+细胞用雷帕霉素预处理4天，然后在培养4天。结果雷帕霉素显著地减少GLUT1sl细胞的增殖，但是用心得安预处理就没有效果。雷帕霉素预处理更多的抑制了GLUT1ngCD31+细胞的增殖，但是心得安预处理的效果是很小。
图11雷帕霉素对GLUT1sl细胞和GLUT1ngCD31+细胞的抑制作用
结论：
本研究中，作者证明GLUT1sl细胞是兼生性干细胞群体。在体内试验它们表型和功能上是内皮细胞，但是在体外（没有肿瘤环境），它们表现出干细胞样性能，在培养过程中它们明显来自于GLUT1ngCD31+细胞，能显示出稳定的内皮细胞表型。目前已认定GLUT1ngCD31+细胞跟HmEC一样。GLUT1sl细胞是跟HmEC相似，但不是完全相同。GLUT1sl细胞在cll/Matrigl植入模型中不能形成灌注血管内皮细胞。它们内皮细胞重新分化能力只限制于表达内皮细胞标志物。IH中GLUT1阳性内皮细胞是否来自于HmSC，还是相反的GLUT1阳性内皮细胞向HmSC的转变还不清楚，这个问题也没办法用IH病人组织试样分析处理。本研究显示GLUT1阳性内皮细胞在IH退化期中减少，表明跟IH复原一样兼生性干细胞在数量上减少。
参考文献：HuangL,NakayamaH,KlagsbrunM,tal.GlucosTransportr1-PositivEndothlialCllsinInfantilHmangiomaExhibitFatursofFacultativStmClls[J].STEMCELLS,,33(1):-45.
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